Técnicas de edición epigenomica para cirrrosis

en un estadio ya avanzado de fibrosis hepática eventualmente nos va a generar cáncer hepatico , las  alteraciones epigenéticas globales en el cáncer, corresponden principalmente a la hipermetilación de los promotores de los genes supresores tumorales  estudios recientes demostraron quese puede medir la metilacion del ADN para una deteccion oportuna de Cancer hepatico , el ADN plasmático tenía hipermetilación detectable (> 5%) para CDKL2, CDKN2A, HIST13G, STEAP4 y ZNF154  ademas de encontranse mutaciones en las  metiltransferasas H3K4 MLL1, MLL2, MLL3 y MLL4 importantes coactivadores transcripcionales requeridos para la expresión de los genes diana p53 posteriores al daño del ADN.
Estos hallazgos revelan la regulación del ciclo celular E2F2 como un nuevo circuito molecular en el cáncer de hígado y brindan una estrategia terapéutica e información innovadora para las terapias contra el cáncer de hígado, basado enla utilizacion  inhibidores epigenéticos de molécula pequeña como el inhibidor de DNMT1 5-azadeoxycytidine y el inhibidor de EZH2 3-deazaneplanocin

links 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5099193/

Técnicas de edición genomica para tratamiento de cirrosis

La edición ergonómica sin duda ha sido el mayor avance en la medicina y a acaparado gran éxito actualmente, las herramientas para edición del genoma utilizadas son: ZFN, TALEN, CRISPR/Cas y ARN Interferente.

• La técnica de edición genética CRISPR es uno de los mayores avances en la medicina actual. Un reciente estudio ofrece una nueva versión de la herramienta que, en lugar de editar ADN en las células humanas, lo hace con ARN. Este método puede alterar la expresión genética sin realizar cambios en el genoma, lo que supone un gran potencial para la investigación y el tratamiento de enfermedades. Además, es capaz de corregir mutaciones en diferentes ventanas de tiempo, incluso durante los períodos de desarrollo clave

• El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo biológico, ampliamente distribuido en eucariotas, por el cual, se consigue silenciar genes, mediante moléculas de ARN de doble cadena (ARNdc). El silenciamiento de genes se da por la interacción de complejos enzimáticos en el citoplasma con pequeñas moléculas de ARN (siRNA), las cuales, actúan sobre el ARN mensajero (ARNm) endógeno, impidiendo que sea traducido a proteína. Es un hecho que el ARNi puede ser una tecnología alternativa en el control de plagas de importancia agrícola, a través del silenciamiento selectivo de genes, considerados esenciales para la sobrevivencia de la plaga. 

• ZFN está formado por dos dominios: dominio de unión a ADN  específico del sitio, derivado de zinc con factor de transcripción y otro de endonucleasa de enzima de restricción Fok1 bacteriana. A través de la selección basada en bacterias, se identifica proteínas que se unen al sitio objetivo.
• TALE serán como factores de transcripción eucarióticos por la unión del ADN para activar la expresión del gen diana. Utilizado para la interrupción de genes específicos.

bibliografia
 Becu D. El Sistema Crispr/Cas9 ¿Cambiará el genoma de la humanidad? [Internet]. Ri.conicet.gov.ar. 2019 [cited 24 June 2019]. Available from: https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/5217
ARN de interferencia. [Internet]. Sylentis.com. 2019 [cited 24 June 2019]. Available from: https://sylentis.com/index.php/es/tecnologia/2-uncategorised/15-arn-de-interferencia
Bernardo Á. El futuro de la edición genómica en el año 2018 [Internet]. Hipertextual. 2019 [cited 24 June 2019]. Available from: https://hipertextual.com/2018/01/edicion-genomica-crispr-cas-2018

Terapia regenerativa en cirrosis hepática

Las células madre mesenquimales (MSCs) son células multipotentes con capacidad de autorenovación, presentes en diferentes tejidos del organismo,estudios muestran resusltados favorecedores para el tratamiento de cirrosis hepatica

Las MSCs pueden incorporarse a tejidos dañados, diferenciarse en componentes del tejido conectivo y colaborar en la reparación tisular  tambien se diferencian  en tipos celulares de las tres capas embrionarias lo que muestra la  Capacidad pro-regenerativa por diferenciación a hepatocitos

el trasplante de MSCs redujo la expresión y producción de colágeno tipo I y III, la expresión de citoquinas pro-fibrogénicas como TGF-β1, α-SMA y TNF- α y la activación de las CEHs80; al mismo tiempo que redujo la apoptosis y estimuló la proliferación de hepatocitos y la angiogénesis8 lo que mejora la calidad de vida y funcion hepatica

La capacidad de las MSCs de migrar preferencialmente a sitios de lesión e injuria sumado a que son capaces de evadir y modular la respuesta del sistema inmunológico con  MSCs modificadas genéticamente con plásmidos o adenovirus que codifican el gen del factor de crecimiento hepatocitario (HGF) se observo reducción del grado de fibrosis y de la activación de las CEHs, expresión de TGF-β1 y colágeno I y III; aumento en la expresión de metaloproteasas y HGF y de la proliferación de hepatocitos lo que muestra que una terapia celular y genetica mejpraria significativamente la funcion hepatica

links bibliograficos

https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/63350

http://recimundo.com/index.php/es/article/view/474

Cirrosis hepática , animales trasngenicos ventajas y desventajas

Un aspecto muy importante, en el estudio de la enfermedad hepática por alcohol, es la posibilidad de disponer de modelos para estudiar la extensa gama de presentaciones clínicas que adopta efecto del alcohol sobre el hígado. 

Es importante tener la posibilidad de investigar, en animales transgénicos y knock-out, por ejemplo, la sobreexpresión de la 7-adenilciclasa, que participa en el metabolismo del alcohol, y en lo que se refiere a la tolerancia y dependencia del alcohol, la deficiencia de tirosina-kinasa y los knock-out de receptores dopaminérgicos y serotoninérgicos que tienen que ver con algunas de las manifestaciones neurológicas. 

El daño hepático por alcohol también se puede estudiar en cultivos celulares, que es lo que está haciendo nuestro equipo. El cultivo entrega un fenotipo estable y homogéneo para investigar, con el objeto de diferenciar los efectos citotóxicos directos y particulares del etanol.

Los cultivos dan la posibilidad de estudiar distintas líneas celulares y distintos aspectos del metabolismo que podrían ser causantes del daño. Las dos líneas principales son los hepatocitos y las células obtenidas a partir de hepatoblastomas, es decir, de células neoplásicas hepáticas. Dichas células permiten estudiar distintos aspectos, especialmente del citocromo y de la deshidrogenasa alcohólica. Otras líneas menos comunes pueden ser muy útiles para estudiar ciertos efectos en particular, como la células HELA, que pueden ser modificadas transgénicamente para el estudio de la deshidrogenasa alcohólica y la deshidrogenasa del acetaldehído. 

Estas son las células más importantes para estudiar los efectos que el alcohol produce en las células y en el proceso de fibrogénesis. Además, en las ratas knock-out se pueden bloquear los CD4 para estudiar precisamente el fenómeno de apoptosis.

ventajas y desventajas 

Ventajas

1.     Determinar partes de génes endógenos para identificar como altera el mecanismo molecular  del huésped.

2.      Aplicación de vacunas con modelos animales para identificar los resultados del estudio. 

3.      Innovar nuevos productos que pueden mejorar la calidad de vida y la intensidad de la enfermedad.

4.       Realizar en un futuro  terapia génica 

5.     Lograr un mecanismo de prevención contra la enfermedad a través de las vacunas inmunoresistentes.

Desventajas

1.      Utilizar tecnologías biológicas y agentes patógenos para propagarlos entre la población. (bioterrorismo)

2.       Provocar una reacción alérgica para el huésped, debido a que no se sabe como puede reaccionar cada individuo al transgénico.

3.       Provocar una resistencia si se administra de manera inconsciente la vacuna con material transgénico.

4.      Provocar un monopolio u oligopolio, es decir una lucración excesiva por el material obtenido en el estudio.

5.      Contaminación genética, es decir,flujo genético no controlado hacia una población salvaje

links bibliograficos
https://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(19)40059-0/abstract

https://misanimales.com/animales-transgenicos-definicion-y-caracteristicas/

https://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(19)40060-7/abstract

ADN recombinante en la naturaleza y ADN recombinante para cirrosis

Un ejemplo de ADN Recombinante que ocurre normalmente en la naturaleza,  es la Recombinación genética, la cual es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de ADN de dos orígenes diferentes.
La información genética de dos genotipos puede ser agrupada en un genotipo mediante recombinanción genética. Por lo tanto está es otra forma efectiva de aumentar la variabilidad genética de una población.
El ADN se recombina de manera natural mediante procesos como la reproducción sexual, la transformación bacteriana y la infección viral. La recombinación genética es el proceso por el cual una hebra de material genético es rota y luego unida a una molécula de material genético diferente.

bibliografia https://ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html

ADN  recombinante para la cirrosis alcohólica 

·         La cirrosis hepática es progresiva e irreversible como resultado final del daño hepatocelular debido a diferentes agentes agresores, que tiene como consecuencia la sustitución del tejido normal del hígado por fibrosis y nódulos de regeneración. El tratamiento ha evolucionado y llegando a la actualidad el uso del interferón pegilado asociado a ribavirina. Para el tratamiento de la Cirrosis se usa Interferon Alfa 2B Recombinante 3 x 106 UI, Ribavirina que son medicamentos que se encargan de retrasar la aparición y disminuir la frecuencia de las posibles complicaciones, disminuir el riesgo de carcinoma hepatocelular, disminuir la progresión o estabilizar el estadio de fibrosis, reducir la necesidad de trasplante hepático y prevenir la recurrencia viral postrasplante. Se ha propuesto la administración de anabolizantes para favorecer la regeneración hepática y de colchicina (1 mg/d, 5 días a la semana) para inhibir la secreción hepatocelular de procolágena y así frenar la producción de tejido fibroso.Transferencia de tecnologías para el sector privado.

lLINKS BIBLIOGRAFICOS

https://patents.google.com/patent/US20190062392A1/en
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124718320540

Microarray en diagnostico de cirrosis hepática

La tecnología de microarrays de ADN permite realizar análisis genéticos sobre miles de genes simultáneamente.
El funcionamiento de los micro- arrays, consiste en medir el nivel de hibridación entre la sonda especifica y la molécula diana. luego los analizamos mediante fluorecescencia y estudios de imagen. En la cirrosis hepática esto es muy útil ya que podemos analizar que genes están activados y cuales están reprimidos cuando se presenta la patología.
En este caso el estudio se basa en el hialuronano (HA) que se lo utiliza como biomarcador para evaluar la gravedad de la enfermedad hepática el  contenido de HA  y su fragmentación se asocian con inflamación y / o fibrosis.

En la cirrosis alcohólica, también se observó HA en la pared sinusoidal y áreas fibrosas alrededor del tracto portal  y vena central y su abundancia en estos lugares disminuyó con la abstinencia de alcohol
se utilizaron microrrays de tejido hepático (TMA) y tinción histoquímica con proteína de unión a hialuronano (HABP) para determinar si el HA hepático aumenta en los donantes con esteatosis y si el contenido de HA se ve afectado por los antecedentes de consumo de alcohol.
El consumo de alcohol fue asociado con un contenido elevado de hialuronano hepático por 3 veces estos datos sugieren  una regulación específica de la etiología de la acumulación de hialuronano en la enfermedad hepática.

links bibliograficos
https://www.xenotech.com/posters/2018/11-2018-sekisui-xenotech-aasld-poster.pdf

Reaccion en cadena de la polimerasa en diagnostico de cirrosis hepática

Extracción de ADN: A todos los individuos estudiados se les tomó una muestra de 3 mL sangre periférica en tubo seco. La extracción del ADN se realizó a partir de 200 µL del suero obtenido siguiendo el método de Lo Iacono.
Método PCR: Se amplificaron simultáneamente, un fragmento de 614 pb de la región Pre S del VHB y un fragmento de 264 pb del gen de la ß-globina, mediante el empleo de los cebadores
En la mezcla de reacción se incluyeron, además, buffer 1x Taq DNA Polimerasa (Promega), 0,2 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (Promega), 1,5 mM MgCl2 (Promega) y 2 unidades de Taq ADN Polimerasa (Amplicen) en un volumen de reacción de 50 µL, usando 5 µL de muestra.
Precisión (repetitividad y reproducibilidad): Se seleccionaron cinco muestras positivas y cinco muestras negativas al azar, las cuales fueron amplificadas por triplicado en tres sesiones de trabajo diferentes por distintos investigadores.

Especificidad clínica: En las 5 muestras de individuos clínicamente sanos, solo se obtuvo amplificación para el gen de la ß-globina y los cálculos demostraron que el método es 100% efectivo en identificar el ciclo replicativo del VHB en los individuos infectados.

Sensibilidad clínica: La eficiencia del método para detectar la replicación del VHB es del 38,72 %.

Prevalencia: En la muestra estudiada se obtuvo una prevalencia del 98,15 % para la replicación del VHB.

VPP: La probabilidad de tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es positivo, es del 100 %.

VPN: La probabilidad de no tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es negativo es del 64%.

Análisis de concordancia: No mostró acuerdo entre las enzimas hepáticas y el PCR ya que se obtuvo una k= 0,022 para una p= 0,07.

Precisión: En las cinco muestras positivas incluidas en los ensayos de repetitividad y de reproducibilidad, se detectaron ambos fragmentos. Las muestras negativas solo mostraron el fragmento de 264 pb correspondiente al gen de la ß-globina.

En las muestras de los pacientes que participaron en el estudio, se obtuvo una baja frecuencia de positividad a la replicación del VHB, en los servicios de Gastroenterología, Hemodiálisis y Trasplante, pero en el Servicio de Hematología fue relativamente alta

LINKS BIBLIOGRAFICOS 

http://www.revmedtropical.sld.cu/index.php/medtropical/article/view/213/189